je cherche des renseignements sur la standardisation du dosage de la PCR. Il paraît qu'en Europe les résultats sont standardisés pour tous les laboratoires , ce qui semble logique.
Le nombre d'exemplaires ABL examiné est different à chaque analyse et mon labo marque en annotation qu'il faut au minimum 10.000 exemplaires éxaminés pour que le résultat soit fiable.Pour ma part, mon premier dosage PCR au diagnostic et avant traitement était de 33 %. Lorsque certains d'entre nous parlent de réduction de 7 logs , cela me paraît énorme surtout si ce sont des logs décimaux et que l'analyse porte sur 10 ou 20.000 exemplaires. Bref ,pour moi une PCR U correspond à un zéro tout court,.
Y a-t-il des labos qui examinent 100,000 ou 1 million d'exemplaires? Si quelqu'un a des réponses je suis prenant. Un grand merci
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partition
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cousineg
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Re: pcr standardisé?
Bonjour Partition,
Voilà une question assez pointue! Je ne peux malheureusement pas te répondre à cette question qui s'adresse plutôt à des chefs de laboratoire qui effectuent le test RQ-PCR (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction ). Au Québec, il y a seulement trois hôpitaux qui font ce test. (Hôpital Maionneuve-Rosemeont, Hôpital Royal-Victoria et le Centre hospitalier affilié universitaire de Québec ). Ces hôpitaux font aussi la greffe de la moelle osseuse. Il y a un spécialiste de LMC dans chacun de ces hôpitaux. Ils sont
Dr Pierre Laneuville pour l'hôpital Royal-Victoria (à Montréal) : http://www.cmleukemia.com/dr-lambert-busque.html
Dr Lambert Busque pour l'hôpital Maisonneuve-Rosemont (à Montréal): http://www.cmleukemia.com/dr-pierre-laneuville.html
Dr Robert Delage pour l'hôpital de l’Enfant-Jésus ( à la Ville de Québec): http://www.cmleukemia.com/dr-robert-delage.html
Dr Mahon de France, sera à Montréal, lundi le 24 octobre 2011. Il est fort problable que Dr Pierre Laneuville sera présent à cette rencontre. J'espère d'être présent aussi pour poser quelques questions. Si tu as une liste de questions, tu peux me les transmettre par ce forum ou en privée. Je ne sais pas si cette rencontre va être enregistrée. Elle sera faite par la Société de LMC du Canada ( http://www.cmlsociety.org/?q=apropos ).
En ce qui concerne Dr Mahon, tu peux aller voir le lien au http://www.cmleukemia.com/dr-franccedil ... mahon.html
Voici mon humble opinion en consultant l'Internet (Tu pourras sans doute trouver d'autres informations plus pertinentes en consultant toi-même l'Internet):
Il existe des laboratoires où il est possible de faire un milliard de copies.
''En moins de dix ans, cette technique (maintenant capable de faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure) s'est imposée dans les laboratoires et a révolutionné la biologie moléculaire.'' Extrait de http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9act ... %C3%A9rase
''Avec le test RQ-PCR, il y a trois phases d'amplifications:
1 - Phase exponentielle - 1 à 100,000 copies
2 - Phase linéaire - 100,000 à 10,000,000 copies
3 - Phase plateau - 10,000.000 copies à 1,000,000,000 copies.
Le test RQ-PCR se concentre surtout sur la phase exponentielle car il fournit les données les plus précises et les plus fiables pour la quantification.''
Extrait de http://www.lifetechnologies.com/feature ... ation.html
Pour toutes autres informations sur le test RQ-PCR, tu peux consulter aussi le lien http://www.cmleukemia.com/polymerase-ch ... ction.html
Au revoir, Gilles
Voilà une question assez pointue! Je ne peux malheureusement pas te répondre à cette question qui s'adresse plutôt à des chefs de laboratoire qui effectuent le test RQ-PCR (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction ). Au Québec, il y a seulement trois hôpitaux qui font ce test. (Hôpital Maionneuve-Rosemeont, Hôpital Royal-Victoria et le Centre hospitalier affilié universitaire de Québec ). Ces hôpitaux font aussi la greffe de la moelle osseuse. Il y a un spécialiste de LMC dans chacun de ces hôpitaux. Ils sont
Dr Pierre Laneuville pour l'hôpital Royal-Victoria (à Montréal) : http://www.cmleukemia.com/dr-lambert-busque.html
Dr Lambert Busque pour l'hôpital Maisonneuve-Rosemont (à Montréal): http://www.cmleukemia.com/dr-pierre-laneuville.html
Dr Robert Delage pour l'hôpital de l’Enfant-Jésus ( à la Ville de Québec): http://www.cmleukemia.com/dr-robert-delage.html
Dr Mahon de France, sera à Montréal, lundi le 24 octobre 2011. Il est fort problable que Dr Pierre Laneuville sera présent à cette rencontre. J'espère d'être présent aussi pour poser quelques questions. Si tu as une liste de questions, tu peux me les transmettre par ce forum ou en privée. Je ne sais pas si cette rencontre va être enregistrée. Elle sera faite par la Société de LMC du Canada ( http://www.cmlsociety.org/?q=apropos ).
En ce qui concerne Dr Mahon, tu peux aller voir le lien au http://www.cmleukemia.com/dr-franccedil ... mahon.html
Voici mon humble opinion en consultant l'Internet (Tu pourras sans doute trouver d'autres informations plus pertinentes en consultant toi-même l'Internet):
Il existe des laboratoires où il est possible de faire un milliard de copies.
''En moins de dix ans, cette technique (maintenant capable de faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure) s'est imposée dans les laboratoires et a révolutionné la biologie moléculaire.'' Extrait de http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9act ... %C3%A9rase
''Avec le test RQ-PCR, il y a trois phases d'amplifications:
1 - Phase exponentielle - 1 à 100,000 copies
2 - Phase linéaire - 100,000 à 10,000,000 copies
3 - Phase plateau - 10,000.000 copies à 1,000,000,000 copies.
Le test RQ-PCR se concentre surtout sur la phase exponentielle car il fournit les données les plus précises et les plus fiables pour la quantification.''
Extrait de http://www.lifetechnologies.com/feature ... ation.html
Pour toutes autres informations sur le test RQ-PCR, tu peux consulter aussi le lien http://www.cmleukemia.com/polymerase-ch ... ction.html
Au revoir, Gilles
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partition
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Re: pcr standardisé?
Merci Gilles, comme d'habitude
Aprés avoir écouté la video du Dr Laneuville, ce que j'ai compris c'est que les dosages standardisés ne se mesuraient plus en diminution de logs mais en pourcentages et que RMM correspond à 0,1% et RMC à 0%. Mon anglais est scolaire mais je crois avoir conpris. Est ce que sur vos résultats figure le nombre d'exemplaires (quantification ABL) analysé ? et s'agit-il de dosage quantitatif ou en temps reel?
Encore merci
Pour encourager les nouveaux diagnostiqués, c'est bien vrai du moins dans mon cas que les effets secondaires s'estompent hormis les douleurs gastriques et nausées.
Aprés avoir écouté la video du Dr Laneuville, ce que j'ai compris c'est que les dosages standardisés ne se mesuraient plus en diminution de logs mais en pourcentages et que RMM correspond à 0,1% et RMC à 0%. Mon anglais est scolaire mais je crois avoir conpris. Est ce que sur vos résultats figure le nombre d'exemplaires (quantification ABL) analysé ? et s'agit-il de dosage quantitatif ou en temps reel?
Encore merci
Pour encourager les nouveaux diagnostiqués, c'est bien vrai du moins dans mon cas que les effets secondaires s'estompent hormis les douleurs gastriques et nausées.
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cousineg
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Re: pcr standardisé?
Bonjour Partition,
Malheureusement, je ne vois pas mes résultats. Depuis deux ans, je suis PCRU. De toute façon, mes rendez-vous avec mon hématologue, ne dure que dix minutes. Cependant, je vais essayer d'avoir une copie des archives de l'hôpital et j'analyserai par la suite, mes tests RQ-PCR. Ta question est pertinente.
En attendant, voici quelques notes extraites d'un cours d'hématologie que tu peux retrouver au lien suivant: http://www.medix.free.fr/sim/leucemie-myeloide.php
Au revoir, Gilles
5- Techniques de détection du chromosome Ph et/ou de son équivalent moléculaire le gène BCR-ABL :
Le diagnostic est habituellement confirmé par la mise en évidence du chromosome Ph ou de son équivalent moléculaire : le réarrangement BCRABL.
Nous avons à notre disposition plusieurs techniques dont l’utilisation varie en fonction de la sensibilité recherchée et du laboratoire.
* Caryotype :
C’est l’examen essentiel qui permet de confirmer le diagnostic.
Il montre dans 95 % des cas, la translocation réciproque t (9 ; 22) (q34.1 ; q11.2).
Cette anomalie est retrouvée dans les précurseurs granuleux, les mégacaryocytes, les érythroblastes, les monocytes.
Les lymphocytes T et B qui proviennent de la moelle osseuse sont eux aussi atteints.
Le caryotype médullaire est essentiel, car il peut montrer des anomalies additionnelles, c’est-à-dire celles associées au chromosome Ph.
Toutes ces anomalies signent une évolution clonale et une accélération de la maladie.
Dans moins de 5 %des cas de LMC, les chromosomes 9 et 22 apparaissent normaux.
La translocation existe, mais n’est détectable qu’au niveau des gènes.
L’étude moléculaire permet alors de prouver qu’il y a réarrangement entre BCR et ABL.
Le caryotype demeure la technique de référence, car c’est la seule qui permette aujourd’hui de prendre des décisions thérapeutiques.
Les résultats qu’il apporte ont permis de définir par exemple des critères de réponse cytogénétique à l’IFN-a.
* Études moléculaires :
+ Southern-blot :
Il permet de mettre en évidence les différents points de cassure dans la région M-BCR.
Il analyse l’ensemble des cellules en cycle et en interphase.
C’est une technique utile uniquement pour les cas de LMC où le caryotype paraît normal.
Cependant, en fonction des sondes utilisées, on peut passer à côté d’un réarrangement moléculaire particulier ; de plus, il s’agit d’une technique peu sensible (5 %).
Enfin, elle ne permet pas de voir d’autres anomalies clonales, en particulier les anomalies chromosomiques additionnelles.
Elle est de moins en moins utilisée à cause de sa lourdeur et de sa faible sensibilité.
+ Amplification génique ou PCR :
La réaction en chaîne de la polymérase ou PCR (polymerase chain reaction) est rapide, très sensible et amplifie le gène chimérique BCR-ABL.
À cause de la variabilité très importante des points de cassure sur l’ADN génomique, elle est réalisée à partir d’ARN et nécessite donc une étape de transcription inverse (RT-PCR).
Elle permet de détecter dans des conditions raisonnables 1 cellule sur 106, mais comporte un risque non négligeable de faux positifs.
Elle a l’avantage de pouvoir se faire sur le sang périphérique.
Pour simplifier, en dehors des recherches cliniques, la PCR est très utile pour tous les diagnostics différentiels de LMC.
La PCR permet aussi d’évaluer la maladie résiduelle, c’est-à-dire d’apprécier le degré de rémission complète quand l’étude par cytogénétique classique n’est plus assez sensible.
+ PCR quantitative :
Il s’agit d’une adaptation de la PCR pour obtenir un résultat quantifiable.
C’est une technique lourde, difficile à standardiser.
Le principe consiste à coamplifier l’ARN ou l’ADN complémentaire avec un échantillon de référence en quantité fixe et connue, de manière à comparer le produit de PCR de l’un par rapport à l’autre.
Pour cela, il est nécessaire de pouvoir distinguer une fois amplifié le produit de référence à doser (tailles différentes ou sites de restriction) et de mesurer l’intensité d’amplification.
Cette technique est lourde et encore difficile à standardiser.
6- Techniques particulières :
* Western-blot :
Actuellement, il existe des anticorps reconnaissant uniquement la protéine ABL ou la protéine BCR.
Il est donc possible d’utiliser la technique de Western-blot qui, en cas de LMC, met en évidence sur le même transfert les protéines BCR-ABL et ABL.
C’est une technique difficilement applicable en routine, mais intéressante car elle permet de visualiser les deux types de protéines chimériques p190 et p210 et de les comparer par rapport à ABL.
Elle permet aussi de mettre en évidence d’autres types de réarrangements comme p230 ou TEL-ABL si on utilise un anticorps anti-ABL.
Aujourd’hui, toute LMC Ph-négative devrait faire l’objet d’une étude parWestern-blot.
* Hybridation in situ ou FISH (« fluorescent in situ hybridization ») :
C’est une nouvelle technique qui permet, grâce à des sondes spécifiques marquées, de détecter directement le réarrangement moléculaire BCRABL .
Elle permet l’analyse de l’ensemble des cellules (noyau en métaphase et/ou en interphase) et permet une évaluation quantitative des résultats.
Elle présente donc des avantages sur la PCR, mais des risques non négligeables de faux positifs dus à la superposition dans l’espace d’ABLet de BCR quand on étudie les cellules interphasiques.
Il semble que les nouvelles sondes permettent d’éviter ces problèmes.
Cette technique devrait donc être de plus en plus utilisée.
Malheureusement, je ne vois pas mes résultats. Depuis deux ans, je suis PCRU. De toute façon, mes rendez-vous avec mon hématologue, ne dure que dix minutes. Cependant, je vais essayer d'avoir une copie des archives de l'hôpital et j'analyserai par la suite, mes tests RQ-PCR. Ta question est pertinente.
En attendant, voici quelques notes extraites d'un cours d'hématologie que tu peux retrouver au lien suivant: http://www.medix.free.fr/sim/leucemie-myeloide.php
Au revoir, Gilles
5- Techniques de détection du chromosome Ph et/ou de son équivalent moléculaire le gène BCR-ABL :
Le diagnostic est habituellement confirmé par la mise en évidence du chromosome Ph ou de son équivalent moléculaire : le réarrangement BCRABL.
Nous avons à notre disposition plusieurs techniques dont l’utilisation varie en fonction de la sensibilité recherchée et du laboratoire.
* Caryotype :
C’est l’examen essentiel qui permet de confirmer le diagnostic.
Il montre dans 95 % des cas, la translocation réciproque t (9 ; 22) (q34.1 ; q11.2).
Cette anomalie est retrouvée dans les précurseurs granuleux, les mégacaryocytes, les érythroblastes, les monocytes.
Les lymphocytes T et B qui proviennent de la moelle osseuse sont eux aussi atteints.
Le caryotype médullaire est essentiel, car il peut montrer des anomalies additionnelles, c’est-à-dire celles associées au chromosome Ph.
Toutes ces anomalies signent une évolution clonale et une accélération de la maladie.
Dans moins de 5 %des cas de LMC, les chromosomes 9 et 22 apparaissent normaux.
La translocation existe, mais n’est détectable qu’au niveau des gènes.
L’étude moléculaire permet alors de prouver qu’il y a réarrangement entre BCR et ABL.
Le caryotype demeure la technique de référence, car c’est la seule qui permette aujourd’hui de prendre des décisions thérapeutiques.
Les résultats qu’il apporte ont permis de définir par exemple des critères de réponse cytogénétique à l’IFN-a.
* Études moléculaires :
+ Southern-blot :
Il permet de mettre en évidence les différents points de cassure dans la région M-BCR.
Il analyse l’ensemble des cellules en cycle et en interphase.
C’est une technique utile uniquement pour les cas de LMC où le caryotype paraît normal.
Cependant, en fonction des sondes utilisées, on peut passer à côté d’un réarrangement moléculaire particulier ; de plus, il s’agit d’une technique peu sensible (5 %).
Enfin, elle ne permet pas de voir d’autres anomalies clonales, en particulier les anomalies chromosomiques additionnelles.
Elle est de moins en moins utilisée à cause de sa lourdeur et de sa faible sensibilité.
+ Amplification génique ou PCR :
La réaction en chaîne de la polymérase ou PCR (polymerase chain reaction) est rapide, très sensible et amplifie le gène chimérique BCR-ABL.
À cause de la variabilité très importante des points de cassure sur l’ADN génomique, elle est réalisée à partir d’ARN et nécessite donc une étape de transcription inverse (RT-PCR).
Elle permet de détecter dans des conditions raisonnables 1 cellule sur 106, mais comporte un risque non négligeable de faux positifs.
Elle a l’avantage de pouvoir se faire sur le sang périphérique.
Pour simplifier, en dehors des recherches cliniques, la PCR est très utile pour tous les diagnostics différentiels de LMC.
La PCR permet aussi d’évaluer la maladie résiduelle, c’est-à-dire d’apprécier le degré de rémission complète quand l’étude par cytogénétique classique n’est plus assez sensible.
+ PCR quantitative :
Il s’agit d’une adaptation de la PCR pour obtenir un résultat quantifiable.
C’est une technique lourde, difficile à standardiser.
Le principe consiste à coamplifier l’ARN ou l’ADN complémentaire avec un échantillon de référence en quantité fixe et connue, de manière à comparer le produit de PCR de l’un par rapport à l’autre.
Pour cela, il est nécessaire de pouvoir distinguer une fois amplifié le produit de référence à doser (tailles différentes ou sites de restriction) et de mesurer l’intensité d’amplification.
Cette technique est lourde et encore difficile à standardiser.
6- Techniques particulières :
* Western-blot :
Actuellement, il existe des anticorps reconnaissant uniquement la protéine ABL ou la protéine BCR.
Il est donc possible d’utiliser la technique de Western-blot qui, en cas de LMC, met en évidence sur le même transfert les protéines BCR-ABL et ABL.
C’est une technique difficilement applicable en routine, mais intéressante car elle permet de visualiser les deux types de protéines chimériques p190 et p210 et de les comparer par rapport à ABL.
Elle permet aussi de mettre en évidence d’autres types de réarrangements comme p230 ou TEL-ABL si on utilise un anticorps anti-ABL.
Aujourd’hui, toute LMC Ph-négative devrait faire l’objet d’une étude parWestern-blot.
* Hybridation in situ ou FISH (« fluorescent in situ hybridization ») :
C’est une nouvelle technique qui permet, grâce à des sondes spécifiques marquées, de détecter directement le réarrangement moléculaire BCRABL .
Elle permet l’analyse de l’ensemble des cellules (noyau en métaphase et/ou en interphase) et permet une évaluation quantitative des résultats.
Elle présente donc des avantages sur la PCR, mais des risques non négligeables de faux positifs dus à la superposition dans l’espace d’ABLet de BCR quand on étudie les cellules interphasiques.
Il semble que les nouvelles sondes permettent d’éviter ces problèmes.
Cette technique devrait donc être de plus en plus utilisée.
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cousineg
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Re: pcr standardisé?
Bonjour Partition,
Comme tu as pu le remarquer, l'extrait précédent du cours d'hématologie, n'est pas à jour. Elle doit dater de 1998, soit avant l'arrivée des ITKs. C'est dommage que l'on n'a pas revisé le texte de ce cours. On ne devrait jamais laisser un texte non revisé sur Internet.
Au revoir, Gilles
Comme tu as pu le remarquer, l'extrait précédent du cours d'hématologie, n'est pas à jour. Elle doit dater de 1998, soit avant l'arrivée des ITKs. C'est dommage que l'on n'a pas revisé le texte de ce cours. On ne devrait jamais laisser un texte non revisé sur Internet.
Au revoir, Gilles
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partition
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Re: pcr standardisé?
Aprés consultation avec mon hémato|: pour que le dosage PCR soit fiable, il faut examiner un mínimum de 32000 exemplaires. Pas de protocole d'arrêt si le PCR ne reste pas à 0 pendant 2 ans , dans un labo trés fiable avec un mínimum de 32000 exemplaires éxaminés à chaque fois.